指数富集的配体系统进化

指数富集的配体系统进化，通常缩写为SELEX，是一种组合分子生物学方法，用于发现适配体：通常是单链DNA或RNA分子，它们折叠成能够结合特定靶标的三维结构。这是一种实验室技术，而非传统的商业品牌、公司、产品线或面向消费者的服务。该方法也被描述为体外选择或体外进化，相关术语包括SAAB和CASTing。 典型的SELEX实验始于一个非常大的化学合成寡核苷酸文库。每个序列包含一个随机化的中心区域，两侧是恒定的引物结合区域。随机部分提供结构和序列多样性，而恒定末端使得扩增和（对于RNA选择）转录成为可能。原则上，长度为n的随机区域可以包含4^n种常规DNA或RNA序列，尽管实际文库大小远小于此，因为合成、扩增、处理和采样都有限制。起始池被转化为单链分子，并在为预期靶标和应用选择的条件下折叠。 然后将文库暴露于靶标。靶标可能包括蛋白质、核酸、代谢物、药物、其他小分子或完整细胞。在经典格式中，靶标被固定在色谱基质、膜或顺磁珠上。未结合的分子被洗去，而保留的序列被洗脱并扩增。DNA选择通常直接使用PCR；RNA选择通常需要逆转录、PCR和体外转录，然后进入下一轮。为下一轮产生干净的单链池是一个核心技术要求，可能涉及不对称PCR、使用生物素进行链捕获或选择性酶降解。 结合、洗涤、洗脱和扩增循环在逐渐更具选择性的条件下重复。研究人员可以降低靶标浓度、缩短孵育时间、增加洗涤严格性或改变缓冲液条件，以有利于更紧密或更具选择性的结合物。可以针对固定基质、相关分子、不需要的蛋白质或非靶细胞类型引入反选择。这可以去除非特异性结合的序列，并改善对密切相关靶标的区分。可以通过测量每轮中保留的文库量或比例来监测选择进展，然后对富集的候选物进行测序和表征。 SELEX支持了用于生物传感器、分析测定、成像、诊断、亲和纯化和治疗研究的适配体的开发。适配体常与抗体试剂进行比较，因为两者都能识别分子靶标，但适配体通过化学合成制备，并且可以针对难以用于常规免疫的靶标进行选择。它们的性质可以通过缓冲液条件、反选择、截短、化学修饰和选择后工程进行调节。然而，非常高的表观亲和力并不自动产生最佳特异性；适配体可能仍然识别相关分子或在复杂的生物环境中表现出不良相互作用。 后来的发展扩大了SELEX的化学和操作范围。修饰的糖和碱基可以增加核酸酶抗性、血清稳定性、疏水相互作用和结构多样性。非天然碱基对也被纳入选择系统，以扩大可访问的化学字母表。基于细胞的选择允许文库针对完整细胞而非纯化靶标进行筛选。其他方法试图避免靶标固定化，这可能会隐藏结合位点或对小分子尤其成问题。一种相关的非固定化方法是FRELEX，被描述为一种非固定化选择策略。尽管有这些创新，SELEX仍然受到理论寡核苷酸序列空间的巨大规模以及合成、扩增、分配和选择过程中引入的偏差的限制。

SELEX于1990年出现，当时正在开发用于选择具有所需结合特性的核酸分子的体外方法。其核心见解是，包含许多不同DNA或RNA序列的合成池可以经历重复的基于结合富集的循环。研究人员不是单独设计每个序列，而是让靶标从大型组合群体中选择兼容的结构，然后将保留的候选物扩增用于下一轮。 原始工作流程使用随机化寡核苷酸文库，两侧是恒定区域。这些固定区域为扩增提供引物位点，而随机化片段产生靶标识别所需的结构多样性。在转化为单链形式后，将文库与选定的靶标孵育。结合序列与非结合序列分离，回收，扩增，并返回下一轮选择循环。重复导致靶标结合序列在池中越来越占优势。所得分子被称为适配体。 几个技术问题塑造了该方法的发展。化学合成可以产生非常大的池，但理论序列空间远大于任何实验可管理的文库。聚合酶链反应可能引入扩增偏差，合成缺陷可能去除或低估潜在有用的序列。保持单链材料也至关重要，因为适配体活性取决于分子采用适当的二级和三级结构。因此，研究人员开发了替代的链分离程序，包括不对称PCR、基于生物素的捕获和一条链的酶促降解。 靶标呈现成为另一个主要变化领域。纯化的蛋白质或小分子可以附着在色谱介质、膜或磁珠上，但固定化可能改变靶标的构象或隐藏表位。细胞SELEX将方法扩展到完整细胞，使得在更复杂的生物环境中选择细胞表面特征成为可能。引入反选择以去除识别支持材料、相关化合物、无关细胞或其他不需要成分的序列。缓冲液组成、温度、盐浓度、孵育时间、靶标丰度和洗涤条件都可以调整以改变选择压力。 SELEX随后成为一个广泛的协议家族，而不是单一严格程序。RNA和DNA选择加入了使用修饰糖、修饰碱基和扩展遗传字母表的工作流程。这些变化旨在提高核酸酶抗性、增加生物体液中的稳定性、创造新的化学相互作用或产生更多样化的三维结构。引物区域也可能影响折叠，导致在需要短、自给自足的适配体时努力减少或去除它们的贡献。 该方法在分析化学、生物传感器设计、分子识别、诊断、成像、亲和试剂和治疗研究等领域找到了用途。适配体可以化学合成并在选择后修饰，但成功的实验室结合本身并不能确定临床效用。特异性、生物稳定性、递送、药代动力学、非特异性相互作用以及在复杂样品中的性能仍然是应用特定的挑战。特别是，选择非常紧密的结合有时可能增加对相关脱靶分子的识别，而不是提高实际选择性。 现代选择系统继续解决常规SELEX的局限性。实验可访问的文库与可能的寡核苷酸序列的完整理论空间相比非常小，富集可能因序列组成、PCR行为、折叠和分配伪影而失真。非固定化方法如FRELEX被开发出来，以减少将靶标附着到固相引起的问题。计算结构预测、高通量测序和机器学习辅助分析可以进一步帮助研究人员跟踪富集并识别有前景的序列家族。然而，文库生成、选择性保留、回收和扩增的重复原则仍然是SELEX的定义基础。

• 2016

  FRELEX被描述

  [1]Systematic evolution of ligands by exponential enrichmenten.wikipedia.org

  开发了一种相关的非固定化适配体选择方法，以解决与靶标固定化相关的局限性。

• 2015

  方法获得二十五年认可

  [1]Systematic evolution of ligands by exponential enrichmenten.wikipedia.org

  《分子进化杂志》特刊纪念SELEX研究和发展约四分之一世纪。

• 1990

  SELEX被引入

  [1]Systematic evolution of ligands by exponential enrichmenten.wikipedia.org

  引入了体外选择方法，用于从大型随机寡核苷酸文库中分离结合选定靶标的DNA或RNA序列。

一个基础的体外进化平台，用于发现合成核酸结合剂，应用于研究、诊断、生物传感和治疗开发。

• 合成核酸结合剂 · 1990

  DNA适配体

  从随机文库中选择的单链DNA分子，用于结合特定靶标。它们可用作亲和试剂、传感器元件、测定组分或研究探针，并可在选择后进行化学修饰。

• 合成核酸结合剂 · 1990

  RNA适配体

  通过转录连接的选择循环产生的单链RNA分子。它们的折叠可以创建靶标结合结构，而化学修饰可用于提高稳定性或抗降解性。

• 修饰寡核苷酸试剂

  化学修饰适配体

  包含修饰糖、碱基或扩展碱基对系统的适配体。这些格式旨在拓宽化学多样性、加强选定的相互作用、提高核酸酶抗性或增强在生物环境中的性能。

• 基于细胞的选择技术

  细胞SELEX试剂和工作流程

  使用完整细胞作为选择靶标的SELEX变体。它们可以富集识别细胞表面分子或细胞表型的序列，而无需完全纯化和固定靶标。

• 1990

  采用迭代体外选择和扩增战略

  背景

  该方法围绕从随机寡核苷酸池中重复富集靶标结合序列而建立。

  采取的行动

  研究人员结合了靶标孵育、保留序列的分离、核酸扩增以及富集池在连续轮次中的再利用。

  后续影响

  该工作流程成为发现针对分子和细胞靶标的适配体的通用平台。

  来源

• 扩展到修饰核苷酸和替代选择格式战略

  背景

  经典SELEX可能受到靶标固定化、核酸酶不稳定性、引物依赖性折叠以及标准核苷酸化学多样性有限的限制。

  采取的行动

  研究人员开发了反选择、基于细胞的选择、化学修饰文库、扩展遗传字母表和非固定化方法如FRELEX。

  后续影响

  SELEX家族变得适应更广泛的靶标和预期应用，尽管文库和选择偏差仍然是重要的限制。

  来源

1. 1Systematic evolution of ligands by exponential enrichmenten.wikipedia.org